Меню Рубрики

Исследуемые материалы при бешенстве

Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

Читайте также:  Абортивная форма бешенства у собак

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

источник

Бионауки: методы Выделение ДНК из клеток (фенольный метод) Выделение ДНК из культуры клеток (высокосолевой метод) Выделение ДНК с использованием протеиназы К Гель-электрофорез ДНК Лабораторные животные в бактериологии Люминисцентная микроскопия: метод флуорохромирования Методика изолированного сердца теплокровного животно Изучение общетоксического действия фарм средств Доклиническое изучение репродуктивной токсичности Курс экспериментальной физиологии Методические указания по диагностике бешенства Исследования на пироплазмидозы животных Диагностика токсоплазмоза животных Изучение нейролептической активности лексредств Исследование мутагенности новых фарм средств Техника вскрытия лабораторных животных

Методические указания по лабораторной диагностике бешенства

(Утверждены Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 27 февраля 1970 г.)

Возбудитель — вирус из семейства Rabdovirusis, его размер 100—150 ммк.

Материалом для исследования на бешенство служит свежий труп мелких животных (собака, кошка, лисица, песец, овца, теленок и др.), голова крупных животных или головной мозг свежий или консервированный в 30—50%-ном растворе глицерина. Его направляют в лабораторию с нарочным.

Из головного мозга делают засев на питательные среды. Часть мозга помещают в стерильный 50%-ный глицерин на буферном или физиологическом растворе и сохраняют в холодильнике на случай необходимости повторного исследования. Из оставшейся части мозга берут материал для микроскопического исследования, серологических реакций и биологической пробы.

Вскрытие трупа, изъятие мозга и другие работы необходимо проводить в условиях асептики при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, защита рук двумя парами перчаток — хирургическими и анатомическими, для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот марлевую повязку).

Для микроскопического исследования делают отпечатки, мазки или срезы из разных участков головного мозга.

Для приготовления отпечатка кусочки головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в 4—6 слоев, срезанной поверхностью кверху. К поверхности среза несколько раз (3—4) подряд прикасаются чистым предметным стеклом, слегка надавливая его, чтобы на стекле получился тонкий отпечаток.

Мазки делают из тех же участков головного мозга. Для этого кусочки мозга растирают в фарфоровой ступке пестиком или в пробирке стеклянной палочкой до образования гомогенной массы, из которой делают грубые мазки на обезжиренном предметном стекле. Можно делать мазки и другим способом. Для этого небольшой кусочек мозга кладут на край предметного стекла, а другим стеклом раздавливают его и размазывают от одного края до другого, в результате чего на поверхности стекла получается тонкий равномерный мазок.

Полученные мазки или отпечатки окрашивают одним из следующих способов.

Окраска по Муромцеву. Влажные мазки или отпечатки сразу же фиксируют в этиловом или метиловом спирте, или в смеси спирта пополам с эфиром, или ацетоном (химически чистым,) в течение 1—2 часов и промывают водой. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы фиксирующая жидкость не испарялась. После промывания водой влажные мазки помещают на 5—10 минут в раствор краски Мансона, разведенной водой 1 :40. Затем краску сливают, а мазки погружают в 10%-ный водный раствор танина на 8—10 минут до появления голубоватой окраски. После этого мазки промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном (химически чистым) или спирта с ксилолом и высушивают фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон, ядра нервных клеток синего цвета, а тельца Бабеша—Негри — бледно-фиолетовые с темными включениями.

Окраска по Селлерсу. На приготовленный влажный от-печаток или мазок наносят на 4—5 секунд смесь реактива А (метиленовый синий 2 г, метиловый спирт 100 мл) и реактив В (основной фуксин 0,5 г, этиловый спирт 100 мл). Рабочий раствор красителя состоит из 15 мл реактива А, 2—4 мл реактива В и 25 мл метилового спирта. После окраски препарат промывают проточной водой и высушивают.

В окрашенном мазке цитоплазма нейронов ярко-синяя, ядрышки темно-синие, эритроциты кирпично-красные, тельца Бабеша— Негри пурпурно-красные с отчетливо видной базофильной структурой.

Окраска по Михину. Мазки или отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира (поровну) в течение 5—10 минут, после чего их просушивают фильтровальной бумагой и окрашивают 30— 40 минут краской Гимза (1—2 капли на 1 мл дистиллированной воды), быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96°-ного спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и исследуют. Если материал был в глицерине, то его предварительно хорошо промывают в воде и просушивают фильтровальной бумагой.

В окрашенном препарате при микроскопическом исследовании основной фон должен быть красным с фиолетовым оттенком. Если преобладает синий фон, мазок снова обмывают подкисленным спиртом и водой. Пирамидальные нервные клетки синеватые, ядро интенсивно черное, а тельца Бабеша—Негри — розово-красные с точечными включениями темно-синего цвета.

Окраска по Борману — Гайнуллиной. Тонкие мазки или отпечатки в течение 5 минут фиксируют в смеси следующего состава: спирта и эфира (поровну) 98 мл, ледяной уксусной кислоты 2 мл. После фиксации их погружают на 5 минут в 10%-ный раствор кристаллической соды, а затем промывают водой и просушивают на воздухе.

Зафиксированные мазки в течение 2 минут окрашивают краской, приготовленной перед употреблением (состав краски — насыщенный водный раствор метиленовой сини 3 капли, насыщенный основной раствор фуксина 2 капли, водопроводная вода 20 мл). Раствор краски наливают на мазок, подогревают на пламени горелки, затем краску оставляют еще на одну минуту, после чего промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

В окрашенном мазке основной фон должен быть ярко-красным, протоплазма нервных клеток красновато-синяя, их ядра — темно-синие, тельца Бабеша—Негри — землянично-красные с типичной гранулярной структурой. Эритроциты имеют вид неокрашенных кружочков.

Реакцию диффузной преципитации в агаровом геле применяют для обнаружения специфического рабического антигена в головном мозге животных, павших от уличного бешенства, а также у животных, на которых ставили биопробу.

Реакцию выполняют на обезжиренных предметных стеклах, на которые наносят 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 60° агара.

Для постановки реакции лучше употреблять агар-агар фирмы «Дифко», он полностью растворяется и сразу не нужно фильтровать. При употреблении других сортов агар-агара необходима тщательная фильтрация.

После застывания агара в нем делают лунки при помощи тонкостенной металлической или стеклянной трубочки с внутренним диаметром 4—5 мм, располагая их согласно трафарету.

Для постановки реакции от крупных животных берут кусочки головного мозга: аммонов рог, кору полушарий, мозжечок, продолговатый мозг; от мелких животных (крысы, суслики, морские свинки, хомяки и др.) рекомендуется проверять в реакции три каких-либо отдела мозга. От мышей берут весь головной мозг, растирают в фарфоровой ступке пестиком и небольшое количество помещают в луночку для антигена.

Остальные четыре луночки заполняют преципитирующим глобулином в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят одновременно на отдельном стекле с использованием того же агара, по тому же трафарету.

После того как ингредиенты реакции помещены в соответствующие луночки, предметные стекла переносят во влажную камеру (чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой или ватой) в термостат на 6 часов при 37—38°. Затем чашки оставляют при комнатной температуре еще на 18 часов.

Учет реакции проводят через 3, 6 и 24 часа. Часто положительная реакция отмечается уже через 3 часа и соответствует образованию одной, реже 2—3 линий преципитации между ближайшими лунками, содержащими антиген и специфический глобулин. Окончательно реакцию учитывают через 24 часа.

Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом приблизительно 45°. Во избежание высыхания агара стекла с реакцией после каждого просмотра помещают в те же чашки Петри, содержащие увлажненную вату (фильтровальная бумага).

Реакция преципитации в агаре — это чувствительный серологический тест, позволяющий быстро и с минимальной затратой реагентов проводить исследование.

Объем используемых ингредиентов 0,02 мл.

При отрицательных показаниях реакции преципитации ставят биопробу.

Реакция иммунофлуоресценции основана на выявлении специальными микроскопами (МЛ-2 Микмед-2-11, ЛЮМАМ и др.) вирусного антигена, вступившего в реакцию со специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующим красителем.

Для реакции делают тонкие и равнослойные отпечатки на тщательно обезжиренных стеклах из свежего или свежемороженного головного мозга. Отпечатки готовят, как и для микроскопического исследования. От каждого кусочка мозга готовят не менее 4 препаратов. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного.

После высушивания на воздухе препараты фиксируют в ацетоне в течение четырех часов при температуре 2—4°. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После фиксации ацетоном на препараты наносят несколько капель конъюгата (флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин) в рабочем разведении. Затем их помещают во влажную камеру (чашки Петри или закрытый эмалированный кювет с увлажненным дном) на 20—30 минут при температуре 25°.

После этого препараты промывают водой или фосфатным буферным раствором (pH 7,2—7,4) в течение часа, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и исследуют.

Препараты просматривают под иммерсионной системой. Для иммерсии используют нелюминесцирующее масло. В окрашенном препарате при люминесцентной микроскопии мозговая ткань флуоресцирует (светится) тусклым серовато-желтым светом. Антиген вируса бешенства выявляется в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины — от едва заметных до 15—20 мк в диаметре.

В контрольном препарате желто-зеленых интенсивно светящихся гранул не отмечают.

По интенсивности свечения результаты оценивают:

+ + + + яркая, сверкающая желто-зеленая люмине¬сценция:

+ + + отчетливо выраженная, достаточно яркая зеленая люминесценция:

++ неяркая люминесценция зеленого цвета;

+ слабая люминесценция, обнаруживаемая в крупных включениях, зелено-серого цвета; — отсутствие специфической люминесценции.

При исследовании с помощью метода флуоресцирующих антител диагноз бешенства считают установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленоватым свечением. В контроле подобных образований не должно быть. При отсутствии положительной флуоресценции необходимо ставить биопробу на молодых белых мышах.

Метод флуоресцирующих антител высокочувствителен и позволяет получить ответ на исследование материала в день его поступления в лабораторию.

Биопробу на бешенство ставят, если получен отрицательный результат: при микроскопическом исследовании (тельца Бабеша— Негри не обнаружены), при серологических реакциях (специфический рабический антиген не выявлен), а также при выявлении атипичных включений.

Биологическую пробу проводят на белых мышах или кроликах. Подопытным животным вводят 10%-ную суспензию, полученную из исследуемого мозга и физиологического раствора или мясопептонного бульона, pH 7,2—7,4. Для приготовления суспензии используют те же участки головного мозга, из которых брали материал для микроскопического и серологического исследований.

Вырезанные участки головного мозга помещают в стерильную пробирку, взвешивают, тщательно растирают в ступке пестиком,, добавляют физиологический раствор или мясопептонный бульон из расчета получения 10%-ной суспензии. Полученную суспензию отстаивают 10 минут и используют надосадочную жидкость.

Если патологический материал был загрязнен, то надосадочную жидкость сливают в другой сосуд (пробирку) и на 1 мл жидкости добавляют по 500—1000 ЕД пенициллина и стрептомицина, после чего отстаивают еще 30 минут при комнатной температуре и используют для заражения. Суспензию готовят в стерильных условиях и при строгом выполнении правил личной профилактики.

Заражают белых мышей весом 8—10 г. Для каждого исследования берут по 6 мышей, из которых трем суспензию вводят в головной мозг, а другим трем подкожно. При заражении в мозг иглу вводят в точке за линией, соединяющей задние углы глаз, и немного в стороне от линии, проходящей посередине головы. Операционное поле протирают спиртом. Суспензию вводят в дозе 0,03 мл. Чтобы игла не проникала глубоко в мозг, на нее надевают ограничитель — небольшой кусочек резиновой трубки, который укрепляют на расстоянии 2—3 мм от конца иглы. При подкожном заражении суспензию вводят в область кончика носа (в верхнюю губу) в дозе 0,05 мл. На месте введения суспензии образуется небольшая припухлость. Зараженных мышей помещают в стеклянные банки и наблюдают за ними в течение 20—25 дней. При положительном результате у мышей обычно на 7—15-й день развиваются симптомы паралитического бешенства.

Вначале отмечают вялость, взъерошенность шерсти и своеобразную горбатость, а также нарушение координации движений. Затем наступает паралич задних конечностей, а позднее — передних, переходящих в общий паралич, заканчивающийся смертью. Продолжительность болезни 2—3 суток.

С развитием общего паралича мышей умерщвляют эфиром или хлороформом. У павших и убитых мышей вскрывают черепную полость, делают засев, из мозга на питательные среды, после чего извлекают головной мозг, из которого готовят препараты для микроскопического и иммунобиологических исследований.

Если в течение 20—25 дней симптомы бешенства у зараженных мышей не проявились, их уничтожают. Банки, в которых они находились, тщательно дезинфицируют.

При постановке биологической пробы на кроликах берут двух животных весом не менее 1,5 кг. Суспензию им вводят в мозг в дозе 0,2 мл. Если материал загрязнен, его обрабатывают, как указано выше, и суспензию вводят еще двум кроликам внутримышечно в дозе 2 мл.

При положительном результате биологической пробы кролики заболевают через 16—21 день. Бешенство у кроликов протекает в тихой, паралитической форме со смертельным исходом. У павших кроликов извлекают головной мозг, и дальнейшее исследование проводят так же, как и при заражении мышей. Наблюдают за кроликами в течение 45—50 дней. По истечении указанного срока незаболевших кроликов уничтожают. Клетки; в которых находились подопытные животные, дезинфицируют.

Гистологическое исследование. Пересылать материал (голову животного) лучше всего с посыльным. Если это невозможно, то материал помещают в водонепроницаемый металлический ящик с плотно пригнанной крышкой, который необходимо поместить в другой, более вместительный, заполнив промежуток между стенками льдом.

В сопроводительной записке указывают вид и породу животного, находилось ли оно в контакте с другими животными, было ли животное убито или оно пало, способ убоя, .находилось ли животное под наблюдением ветеринарного врача до момента смерти и какое время, наблюдаемые симптомы, данные о вакцинации против бешенства.

Вскрытие трупа, извлечение мозга и другие работы проводят при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, работа в перчатках, защита глаз очками, на рот и нос надевается марлевая повязка).

Извлечение мозга. После закрепления головы животного секционным ножом по средней линии разрезают кожу, фасции и мышцы головы. Разрез начинают на уровне глаз и ведут кзади к основанию черепа, обнажая кость. Кости черепа распиливают хирургической пилой. Два продольных распила проводят от большого затылочного отверстия кпереди с обеих сторон, а затем соединяют их поперечным распилом на лобной кости непосредственно на уровне глаз. Выпиленный кусок кости приподнимают костными щипцами или долотом. Рассекают мозговую оболочку и мозжечковый намет, отделяющий мозжечок от большого мозга. Этим же скальпелем отсекают мозг на уровне продолговатого мозга, пересекая черепно-мозговые нервы и ножку гипофиза. Весь мозг извлекают из черепа и помещают в кювет. Все операции выполняют стерильными инструментами.

Обнажить аммонов рог (наиболее подходящий участок для обнаружения телец Негри) нетрудно. На дорсальной поверхности полушария мозга стерильными ножницами проводят продольный разрез, идущий на 2 см латеральнее средней линии. Разрез начи¬нают от затылочного полюса и ведут кпереди на протяжении 3— 5 см. В глубину разрез проникает до бокового желудочка. Разводя края мозгового вещества в месте разреза, можно увидеть аммонов рог — полуцилиндрическое белое блестящее тело* выбухающее на нижневнутренней стороне желудочка. Он имеет спиральный кон¬тур, а на разрезе характерную закругленную поверхность.

Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога, коры больших полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и нервных узлов и фиксируют их в смеси Буен—Дюбоско—Бразиль, состоящей из 40%-ного формалина (500 мл), 96%-ного этилового спирта (1100 мл), дистиллированной воды (100 мл), ледяной уксусной кислоты (120 мл), пикриновой кислоты (8 г).

Сразу после фиксации без промывки материал обезвоживают и кусочки заливают в парафин.

Окрашивают гистологические срезы по методу Manna, Sellersa или по методу Туревича.

Окраска по Manny позволяет тонко отдифференцировать тельца Бабеша—Негри.

Депарафинированные срезы доводят до воды, а затем окрашивают в смеси, состоящей из 1%-ного раствора метилового (не метиленового!) синего (18 мл), 1%-ного водного раствора эозина (23 мл) и дистиллированной воды (49 мл) в течение 18—24 часов при комнатной температуре, затем промывают водой, быстро обрабатывают абсолютным спиртом и дифференцируют до порозовения (около 10 минут) спиртовым раствором едкого натрия, состоящим из 1,5%-ного раствора едкого натрия (1 мл) и абсолютного спирта (30 мл). Далее срезы промывают водой до приобретения ими бледно-голубой окраски, обезвоживают в спиртах, обрабатывают карбол-ксилолом и заключают в бальзам.

Результат окраски: тельца Бабеша—Негри — ярко-красные, ядрышки нейронов — фиолетово-красные, хроматин — синий, цитоплазма — темно-синяя, эритроциты — розовые.

Окраска по Sellersу. Реактивы: первый — метиленовый синий (10 г), метиловый спирт (без следов ацетона) (1000 мл); второй — основной фуксин (5 г), метиловый спирт (без ацетона) (500 мл). Пользуются препаратами с высоким содержанием красителей (метиленовый синий не менее 85%, фуксин не менее 92%).

После освобождения от парафина срезы окрашивают погружением в смесь, состоящую из основного раствора фуксина (6 мм), основного раствора метиленового синего (10 мл) и абсолютного метилового спирта (50 мл). Время окрашивания (2—10 минут) зависит от толщины среза. Промывают водопроводной водой, просушивают фильтровальной бумагой, не пользуясь спиртом, и заключают в бальзам.

Результаты окраски: тельца Бабеша—Негри каштаново-красного цвета имеют вид вакуолей в сине-фиолетовом нейроне. Внутренние структуры окрашиваются в темно-синий цвет подобно ядрышкам нервных клеток. Эритроциты медно-красные, чем отчетливо отличаются от телец Негри.

Патологогистологическая диагностика бешенства состоит в обнаружении признаков острого энцефаломиелита: преимущественно вокруг мелких вен обнаруживают периваскулярные инфильтраты, состоящие в основном из лимфоидных клеток, имеющих вид клеточных муфт. В ганглиозных клетках головного мозга могут быть хроматолиз, вакуолизация и острое набухание клеток, а также гибель отдельных клеток. В области поврежденных нервных клеток довольно постоянна пролиферативная реакция глии, принижающая форму истинной нейронофагии с последующим замещением нервных клеток элементами размножившейся глии. Такое скопление клеток пролиферата на месте распавшейся нервной клетки носит название узелка бешенства — на срезе иногда можно проследить процесс развития узелка.

Достаточно выраженные изменения, аналогичные описанным, наблюдаются в ткани нервных узлов и особенно в верхнешейных узлах. При гистологическом исследовании находят обширные клеточные инфильтраты в ретикулярной строме узлов и адвентиции сосудов, а также явления истинной нейронофагии. Клеточные инфильтраты, как и в головном мозге, состоят из лимфоидных и плазматических клеток. Также организуются узелки бешенства. Благодаря сохранившейся капсуле нервных клеток узелки бешенства имеют хорошо выраженные границы.

Специфическим для бешенства является наличие в цитоплазме нервных клеток телец Бабеша—Негри. Если животное погибло от бешенства, то тельца Бабеша—Негри обнаруживаются сравнительно легко. Если животное было убито, то смерть его могла наступить до появления специфических изменений. По форме и величине тельца Негри весьма разнообразны, находятся в цитоплазме и отростках нервных клеток в виде многочисленных или одиночных экземпляров. Чаще тельца Бабеша—Негри обнаруживают в крупных ганглиозных клетках, причем клетки, содержащие их, не имеют выраженных признаков дегенерации.

Тельца Бабеша—Негри имеют сложную структуру. Основное вещество их ацидофильно, поэтому при окрашивании с применением основного фуксина и эозина тельца приобретают цвет от розового до алого. Наиболее характерным признаком телец Негри является их внутреннее строение, оно и считается необходимым критерием для постановки положительного диагноза на бешенство. Для целей диагностики важно установить наличие темно-синих гранул, независимо от числа и положения их в субстанции тельца. Исследовать необходимо не менее 6 препаратов, взятых из различных отделов головного мозга и нервных узлов.

При гистологическом исследовании нередко обнаруживают другие включения, которые из-за ряда сходных признаков иногда принимают за тельца Негри. Следует иметь в виду, что в мозгу здоровых кошек и белых мышей иногда содержатся неспецифические ацидофильные тельца-включения. Эти тельца можно отдифференцировать от телец Негри по отсутствию внутренних гранул и гомогенности основной субстанции. Небольшие ацидофильные внутрицитоплазматические тельца-включения, не имеющие внутренней структуры, встречаются у животных, убитых в ранних стадиях бешенства. Вот почему рекомендуется содержать животных, находящихся под подозрением, на карантине до их естественной смерти, а не убивать их сразу же.

источник

Бешенство (Rabies) – инфекционное заболевание, опасное для животных и человека. Данное заболевание встречается во всех странах мира. Характеризуется 100% летальным исходом.

Возбудитель – РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Рабдовирусов. Данный вирус имеет тропность к нервной ткани. В наибольших титрах обнаруживается в головном мозге больных животных. Кроме того, находят вирусы и в спинном мозге, слюнных и слезных железах.
Различают:

  1. «дикий» вирус, который циркулирует в естественных условиях и характеризуется высокой патогенностью для человека и животных.
  2. И «фиксированный», полученный в лабораторных условиях, не патогенный для животных и человека при экстраневральном введении.

Вирус бешенства не устойчив к высоким температурам: при 60С о инактивируется через 10 минут, при 100С о — почти мгновенно. Но вот в замороженном мозге может сохранять жизнеспособность до нескольких месяцев. Также сохраняется несколько месяцев в гниющих тканях. Устойчив к действию растворов йода. Но быстро инактивируется дезрастворами на основе формалина, хлорамина и щелочи.

К вирусу бешенства восприимчивы все теплокровные. Наибольшей чувствительностью обладают дикие собачьи (такие как: лисицы, песцы, волки, енотовидная собака, шакалы), куньи, грызуны кошки. Менее восприимчивы птицы.

В дикой природе резервуарами вируса бешенства являются хищные животные и летучие мыши, в городе — бродячие собаки.
Источником заражения являются больные животные, у которых вирус выделяется со слюной. Наличие вируса в слюне отмечают уже за 8-10 дней до появления признаков болезни. Заражение происходит при укусе, при попадании слюны на слизистые оболочки или на поврежденные участки кожи.

После проникновения в организм вирус начинает размножаться в месте внедрения. И через 24 часа начинает проникать в нервную ткань. В нервах он продвигается в направлении спинного и головного мозга со скоростью 7 см/день. Добравшись до мозга вирус начинает усиленно размножаться, затем по нервам вирус попадает во все органы и в первую очередь в слюнные железы и глаза. Инкубационный период (от момента заражения до появления клинических признаков) составляет в среднем 14 – 60 дней, иногда может достигать 6-12 месяцев.
Клинические признаки.

Различают 3 вида течения болезни.

  1. Классическое трехэтапное течениеили буйная форма. Вначале отмечается изменение поведения животного (1 этап), оно становится очень ласковым или наоборот пугливым, необщительным. Этот этап может длиться от нескольких часов до 4 дней. Затем наступает следующий этап — возбуждения (2 этап), который продолжается 1-4 дня. Животные становятся агрессивными, склонны к блуждающим передвижениям и нападением на животных и людей. Развивается анорексия, беспокойство, слюнотечение. И за 3-4 дня до смерти развиваются паралитическая, или депрессивная, стадия, характеризующаяся прогрессирующими параличами.
  2. Паралитическая, или тихая, форма. Характеризуется развитием параличей без предшествующей стадии возбуждения. При этой форме отмечают слюнотечение, отвисание нижней челюсти, затрудненное глотание, анорексию. Затем развивается паралич мышц туловища и конечностей. Смерть животного наступает через 3-4 дня.
  3. «Атипичное бешенство». Это хроническое субклиническое (без развития симптомов) течение болезни, которое может длиться до 3 месяцев.

Предварительный диагноз ставят на основании анамнеза и клинических симптомов. При подозрении на бешенство после смерти животного в лабораторию направляют труп животного. При невозможности этого – голову или головной мозг. При взятии материла необходимо соблюдать строгие меры предосторожности!
Лабораторная диагностика бешенства включает в себя несколько методов исследования.

  1. Обнаружение телец Бабеша-Негри. Для постановки диагноза на бешенство в лаборатории проводят гистологическое исследование головного мозга умершего животного. Отмечают наличие рабических узелков в структурах дна четвертого желудочка мозга и наличие в головном мозге телец Бабеша-Негри (цитоплазматические эозинофильные включения, состоящий из частиц вируса бешенства). Их можно обнаружить в гипокампе, корковых и стволовых структурах мозга, в мозжечке и дорсальных ганглиях спинного мозга и эпителии роговицы глаза. Однако если тельца Бабеша-Негри не обнаруживаются, бешенство не исключается.
  2. Выявление антигена методом флюоресцирующих антител (МФА) или методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФА). Кроме этих реакций в настоящее время идет разработка нового метода диагностики в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
  3. Биологическая проба с заражением новорожденных мышат вирусом из взвеси головного мозга, слюнных желез.

Согласно законодательству РФ, в случаях покусов людей собаками или другими животными (кроме явно больных бешенством) пострадавшие должны немедленно обратиться в медицинские учреждения. А покусавшие их животные должны быть доставлены в ближайшее государственное ветеринарное учреждение для осмотра специалистами и карантина в течение 10 дней.

Для профилактики распространения бешенства предусмотрена ежегодная обязательная вакцинация собак и кошек антирабическими вакцинами.

В настоящее время для ввоза животных в ряд стран требуется документ подтверждающий количество валидных антител к вирусу бешенства. Для эффективной защиты от бешенства минимальный уровень вируснейтрализующих антител в крови должен составлять не менее 0,5 МЕ/мл. Данный вид исследования не является диагностическим и предназначен только для определения напряженности иммунитета против бешенства.
В Москве сдать кровь для определения титра антител к вирусу бешенства можно в Центре Молекулярной Диагностики, расположенном на Звенигородском шоссе, д.5. ЦДМ получил международную аккредитацию на проведение данного теста и выдает Международные сертификаты, действительные в течение всей жизни животного при соблюдении сроков ревакцинации.

Определение титров антител проводят не ранее чем через 30 дней после вакцинации. Поэтому если Вы планируете выезжать со своими питомцами в страны ЕС или другие страны, то необходимо заранее позаботиться о вакцинации и сдаче крови на этот тест (результаты выдаются через 7-14 дней).

Врач-лаборант ветеринарной лаборатории
«БиоВетЛаб» Лазарева Н.В.

Общий клинический анализ крови у кошек при проведении первичного обследования или во время мониторинга состояния больного животного является одним из самых главных лабораторных исследований. Он позволяет объективно дополнить и уточнить данные клинического осмотра, провести первичную диагностику заболевания, оценить тяжесть течения и прогноз болезни.

Патологоанатомическое вскрытие животных – это один из способов установления причины гибели домашнего питомца.

источник

Бешенство — острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с леталь­ным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие жи­вотные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфек­ции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от ме­ста и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1—3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основ­ном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у со­бак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (па­ралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бе­шенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения мо­жет не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Про­никая с периферии (место укуса) по нервным стволам в централь­ную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae,родуLyssavirus. Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион виру­са — РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5—10 мин, солнечный свет — за 5—7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5—10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наруж­ный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих анти­тел, а нуклеокапсидный — комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в централь­ной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культи­вируется на мышах, кроликах, морских свинках и других живот­ных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предваритель­ной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуци­рует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они переда­ют вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основ­ным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, име­ющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным мате­риалом необходимо строго соблюдать меры личной безопаснос­ти: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, ре­зиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защит­ные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством жи­вотных в полевых условиях запрещено.

Получение пат.материала. Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных — голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектици­дами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые меш­ки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика. Она включает: обнаружение вирус­ного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуо­ресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ. На обезжиренных предметных стек­лах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов голов­ного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воз­духе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влаж­ную камеру при 37 °С на 25—30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, спо­ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, нано­сят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуорес­цирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицатель­ным считают результат при отсутствии специфической флуоресцен­ции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, име­ющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве ан­тител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспери­ментальной инфекции (биопроба).

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначен­ные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

источник